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CX Genomics 3′ 技術

1、技術優勢

? ? ? ? ??高精度：單細胞精度達到90%以上

? ? ? ? ??高通量：每個樣本最多可以檢測到上萬個細胞

? ? ? ? ??周期短：一天之內完成細胞懸液制備、單細胞捕獲、擴增以及建庫。

? ? ? ? ??應用范圍廣：動物細胞和植物細胞均可以進行單細胞測序，已廣泛應用于細胞異質性、免疫細胞群體檢測和胚胎發育研究等。

2、實驗操作方法及流程

??如圖所示，Pure-Cell單細胞測序系統利用微流控系統將含有Barcode、UMI（unique molecular identifier）和Poly（dT）的Bead、細胞和油三者混合，形成上萬個納米級油包水的微體系。油包水結構形成后，細胞在其中裂解，釋放出mRNA，Bead利用PloyT引物捕獲液滴中的mRNA。隨后破壞油包水結構，收獲捕獲mRNA的Beads，進行逆轉錄，產生帶有Barcode和UMI信息的cDNA，構建標準測序文庫。

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2.1 單細胞懸液制備

??新鮮組織樣本需要消化成單細胞懸液，對于培養的細胞或已經處于懸浮狀態的細胞，需要對細胞洗滌以去除培養基。單細胞懸液制備完成后需盡快進行上機捕獲，也可通過細胞保存液進行短時間內保存。單細胞轉錄組測序要求樣本細胞活率>85%，細胞濃度在700-1200細胞/μl，細胞數量在5×106以上。/p>

2.2 細胞分選

??如上圖所示，Pure-Cell單細胞測序系統運用微流控+人工智能系統進行細胞分選，懸浮在裂解液的Beads勻速地從左方（圖示）進入，待分選的細胞從下方（圖示）以一定時間間隔進入，與Beads一起進入油相中形成油包水結構。如下圖所示，Beads上的寡核苷酸鏈依次為Illumina Nextera Read 1測序引物、12bp Barcode序列（用于區分細胞）、8bp UMI（區分細胞的不同轉錄本并去除PCR Duplications，降低擴增偏好性）、30 bp poly dT。在隨后的文庫構建中，相同的細胞擴增出的cDNA帶有相同的細胞Barcode，其中來自相同的轉錄本的cDNA會帶有相同的UMI，由此，便可區分出不同細胞擴增出的cDNA。一般而言，每個油包水只會包含一個細胞和一個凝膠珠，但有時候也會出現其他情況，對于這種情況則需要通過在后續分析中識別出來并進行去除。

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2.3 cDNA生成與擴增

??在油包水結構中，Beads中的polyT捕獲mRNA中的polyA。隨后進行破油，并進行逆轉錄反應生成cDNA。隨后進行cDNA的擴增反應，純化后進行質檢，質檢合格后進行文庫構建。

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2.4 文庫構建

??cDNA擴增完成后，利用Tn5酶將cDNA打斷成片段，并加入測序引物接頭，連接Read2測序引物，并通過PCR擴增引入樣品Index、P5、P7接頭，最后進行片段篩選，從而構建含有P5和P7接頭的cDNA文庫，文庫質檢合格后再上機測序。

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2.5 文庫測序

??文庫質檢合格后，就使用Illumina雙端測序平臺進行測序。如圖所示，Illumina測序的核心在于利用可逆終止的、熒光標記的dNTP進行邊合成邊測序（Sequencing-By-Synthesis,SBS）。

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